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植物源殺菌劑的研究概況

植物源殺菌劑的研究概況

              自1925 年 Barger.W.R 等人研制出硼砂殺菌劑后,因其使用成本低、操作方便,見效快,而在農產品生產及食品防腐保鮮中廣泛應用。伴隨防腐殺菌劑大量使用,食品中有毒害物質殘留給人類健康及生態環境帶來很大危害。據報道,多菌靈、托布津等對人、畜造成毒害、致畸作用;三唑類有機化合物的致癌性及殘留及食品中的二氧化硫引起嚴重的過敏反應;據 National Academy of Sciences(NAS)(1987)報道食品中殺菌劑的殘留比殺蟲劑和除草劑對人類的致癌作用更強。同時化學殺菌劑的大量使用致使一些病害產生抗藥性,使化學殺菌劑的藥效大大降低,使用劑量不斷加大。因此研制開發天然、安全、高效的新型殺菌劑,尤其是從植物資源中尋找殺菌活性成分已經成為當前研究的熱點之一。

1.抑菌植物資源篩選

   植物是抑菌物質的天然資源庫。Ahmed 1985 年報道,全世界已有 1600 多種具有控制有害生物的高等植物,其中抗真菌的有 94 種;Wilkins 等 1989 報道有 1389 種植物將有可能作為殺菌劑;世界植物中已知產生的次生代謝產物超過 40 萬種(SWAIN T,1997),其中一部分具有抗菌活性。

我國植物資源豐富,《中國有毒植物》收錄了有毒植物 1300 余種.其中許多具有殺蟲、殺菌作用,有可能被作為植物源農藥利用。《中國土農藥志》共記述植物性農藥 220 種,主要為毛蕊科、杜鵑花科、大戟科、茄科、百合科等有毒植物種類。近年來一些學者對植物源殺菌劑的篩選作了大量工作,佘世望等(1997)對 60 種食藥兩用中藥進行了抗 19 種常見食品腐敗菌的快速篩選,發現丁香、花椒、高良姜料,有較強的抗真菌作用;烏梅對所測細菌有較強抑制作用。王樹桐等(2006)對 126 種中草藥的乙醇提取物進行了室內抑菌活性測試,發現月季、雞冠花和貓爪草的乙醇提取物有很好的抑菌效果。胡美姣等(2007)用72 種中草藥提取物對香蕉、杧果果實采后病害病原菌的抑菌活性進行了篩選;喻人昭等(2004)對 49 種植物源粗提物對黃瓜灰霉菌的生物活性進行了篩選;陳嬌等(2002)對 58 種植物提取物對葡萄霜霉病菌的抑菌活性進行了篩選研究,大量研究結果進一步縮小了植物源殺菌劑的篩選范圍。針對殺菌資源調查散亂,缺乏系統性的特點,西北農林科技大學(于平儒等,2001,2003;李玉平等,2003;馮俊濤等,2001,2002;韓建華等,2002;邵紅軍等,2003)對西北地區的 50 余個科共 200 多種植物樣品提取物進行了抑菌試驗;四川大學對青藏高原東南部區域的殺蟲、抑菌植物進行了調查和篩選,獲得 33 科、90 余屬,220 種植物的活性成分并構建了數據庫。通過不斷篩選,發現抗菌植物多來自十字花科、菊科、豆科、唇形科、茄科、樟科、百合科、紅樹科、麻黃科、馬兜鈴科、木蘭科、桃金娘科、姜科、莎草科、銀杏科、馬尾藻科,同時發現丁香、高粱姜、細辛、黃連、大黃、五味子、山蒼子等一大批殺菌作用良好的植物。                               

2.植物源殺菌劑抗菌成分研究

    近年來,植物源殺菌劑的研究倍受國內外研究者關注。植物源殺菌物質的提取、分離、鑒定技術的發展,使我們從天然植物中提取具有殺菌或抗菌的化學成分,研制、開發應用植物源殺菌劑成為可能。植物中抑菌成分的研究取得了一定的進展,五倍子提取物主要的活性成分3,4,5-三羥基苯甲酸對芒果果蒂腐病具有抑菌作用(楊勝遠等,2001);黃連含有的生物堿對水稻白葉枯病均有很強的抑制作用(朱振東等,1991);山雞椒揮發油中的檸檬醛對尖孢鐮刀菌、蠕孢菌、格孢腔菌的生長有很強的抑制作用(黃梁綺齡等,1994);芒果果實中含有的間苯二酚對炭疽病具有一定的抑制效果(Kobiler et a1,1998)。從毛蒿植物中分離的毛蒿素,從南歐丹參中分離出的硬尾醇(sclarea1),存在于苜蓿根部的苜蓿酸,海紅豆中的紫檀素等均表現出較強的抗真菌活性。從銀杏樹中提取分離的活性物質制成的綠帝乳油對多種蔬菜、蘋果、小麥、棉花均有顯著的殺菌、抑菌作用,作為一種廣譜殺菌劑而在生產中應用。

    研究者對天然植物提取物的抑菌成份進行了分析鑒定,發現抑菌成分主要為含氮含硫化合物、萜類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物,其中酸類、醛類、酚類、醇類等大多具有廣譜的抗菌性,如肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、桂醛、百里酚、丁香酚、香茅醇等,可抑制大量的細菌、霉菌和酵母菌生長繁殖(楊勇,1999)。劉海燕等(2005)將植物中抗菌有效成分歸納為四大類,萜類化合物及其衍生物;生物堿、酰胺及蛋白質等含氮含硫化合物;脂肪類化合物,主要是長鏈碳烷和脂肪酸;芳香族化合物,包括酚類黃酮類以及芪類等。吳新安、李永夫等(2002;2003)按其結構類型將其細分為萜類、生物堿類、黃酮類、苷類、皂甙、醌類、酯類、酚類、醛類、醇類、甾類,另外還有單寧、黃酮類、有機酸、蛋白質。

3. 植物源殺菌劑的作用機理

  天然抑菌植物篩選及其有效殺菌成分的鑒定、分離為研究植物抑菌活性物質的的作用機理奠定了基礎。植物源殺菌劑主要通過抑制孢子萌發和生長;破壞微生物細胞膜,影響能量代謝途;抑制微生物呼吸;提高植物自身的抗性等幾個方面起作用。

3.1抑制孢子萌發和生長

    植物源殺菌劑的殺菌作用多是通過抑制病原菌孢子的萌發和菌絲的生長來實現的。黃連含有的大量生物堿對植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發有較強的抑制作用。張雙喜(1989)研究發現魚藤酮提取物能抑制某些病菌孢子的萌發和生長。Cole 等(1991)從 Scutellaria 屬植物中分離獲得兩種新的雙萜類化合物,可抑制尖孢鐮孢霉等病原菌的菌絲生長及分生孢子萌發。蔣繼志等(1996)采用改進的纖維素膜技術發現馬鈴薯和洋蔥水溶性成分對致病疫霉菌(Phytophthora infestans)游動孢子萌發和附著孢形成具有很強的抑制作用;大蒜油、香茅油及木賊提取物對馬鈴薯晚疫病的孢子萌發、菌絲生長及葉片的侵染有一定的抑制作用 (曹克強等,2001)。從苦參根中分離得到一種 32KD 凝集素蛋白(SFL),對棉花枯萎病菌(Fusariμm vasinfectμm)菌絲的生長有很好抑制效果(馬志剛等,2001)。白頭翁提取物制劑 910512-5 對小麥赤霉病有較高的抑制率,可抑制菌絲擴展,使菌絲萎縮,已在生產中應用(吳恭謙,1995)。

3.2破壞微生物細胞膜

    天然植物中普遍存在精油,醇類,萜類,有機酸類等可以改變真菌細胞的流動性、降低細胞膜的穩定性,致使細胞膜受損、細胞內離子滲漏。這些中草藥提取物通過作用微生物細胞膜、抑制酶的活性來抑制或殺滅細菌、真菌、酵母等微生物。丁香羅勒精油可以使白假絲酵母菌的細胞壁增厚、分離.影響細胞壁的完整性,進而使白假絲酵母菌的出芽率降低(Nakamura C V et a1,2004);精油中的類萜類可降低生物膜的穩定性,干擾了能量代謝的酶促反應(李宏,2002)。Ngucfack J等(2004)研究了3種植物精油對無害利斯特菌(Listeria innocua)的作用機理,發現精油可增加細胞膜的滲透性。從三葉草中亦分離出一種植物皂角甙能有效防治 Phytophthoraci nμmomi Rands 生長,其作用機理通過影響細胞膜的蛋白質、磷脂及甾體,從而破壞細胞膜的穩定性(屠予欽,1999)。Martin Bard 等研究發現香葉醇可提高細胞 K+ 外滲漏并增加真菌細胞的流動性、降低細胞膜脂質層的相變溫及膜脂的流動性(方德秋等,1994;江志利等,2002)。脂肽類化合物通過抑制活力細胞壁多聚體1.3-α-D-葡聚糖的合成,具有廣譜抗菌作用。丙氨酸外消旋酶抑制劑,如pradimicin類化合物結合真菌表面甘露糖蛋白中的糖部分,導致細胞內鉀離子的滲露和細胞形成的嚴重改變(郝小江等,2000)。檸檬醛能破壞黃曲霉細胞壁、質膜、改變膜的選擇通透性,同時能使菌絲體DNA、RNA、脂類和蛋白質等生物合成受到抑制,導致細胞死亡(羅曼等,2001;2002)。

3.3影響能量代謝途

    植物源殺菌劑可通過影響菌體正常的能量代謝,抑制電子傳遞及氧化磷酸化,從而影響代謝中間物質的合成,導致代謝失衡,達到抑制病菌的目的。體外 BTG505(bicyclic 1,4-naphthoquinone)抑制線粒體細胞色素C氧化酶,董尼酮(tricyclic 1,4-naphthoquinone)抑制線粒體氧化磷酸化,造成菌體代謝失衡而死亡(Bhupinder PS et al,2003);K Knobloch等(2003)研究多種萜類對菌類的初生能量代謝、NADH及丁二酸脫氫酶(SDH)活性、呼吸過程的電子傳遞過程的影響,發現在5×10 mol·L-1 濃度下,所有供試萜類都能抑制上述反應,可能通過影響菌類的呼吸作用及細胞膜功能,起到抑菌的作用。大蒜素的作用機理是分子中硫代磺酸基團與菌體中含琉基的物質反應,抑制了菌體正常代謝所需的重要物質(趙歡善,1983)。24-(R,S)-25-epiminolanosterol具有抑菌活性,其作用機理是能夠抑制甾醇生物合成途徑(王理達等,2001)。

3.4提高植物自身的抗性

    大多數植物自身具有防御病害的能力,許多研究者期望通過提高植物的免疫力或誘導其產生抗病性,作為控制病害的一個途徑。一些植物源殺菌劑可以通過影響被保護植物的本身系統來產生抗性。Lyon等(1995)指出一些植物化合物能夠引起植物本身系統抗性的產生,防止病原菌的侵染。歐洲防風草和紫草葉子提取物強烈抑制了禾白粉菌(E rysiphe graminis)無性孢子和禾柄銹菌(Puccinia graminis)夏孢子的萌發,結果發現植物提取物通過激發了小麥自身的合成系統,使得光合系統 II 釋放O2(Karavacv V A et al,2001)。蔣繼志等(2001)采用纖維素膜技術研究大蒜、洋蔥、大黃及中草藥對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長、游動孢子的產生、附著胞形成及侵入絲形成的影響,用提取物免疫處理種薯,誘導成株抗病性、增加塊莖的產量進行研究,取得了顯著效果。萬壽菊根的乙酸乙酯粗提物能鈍化鐮刀菌產生的鐮刀酸,誘導西瓜保護酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(PDP)活性提高,減輕西瓜枯萎病菌(Fusarimn oxysporμm Schlecht.f.sp.niveμm)粗毒素對幼苗的毒害作用(陳紅兵等,2003)。

    一些植物的提取物可抑制、鈍化、中和病菌產生的毒素,具有一定防病作用。劉學端、肖啟明等(1997)利用甘草、連翹等幾種中草藥復配成 MHll-4 wP,對CMV、TMV有強烈的體外鈍化、抑制其增殖和誘導抗病性的作用。此外,有些植物的提取物可以引起蛋白質變性,從香茹中提取的苯恩特對TMV 的抑制作用,電鏡下可觀察到病毒凝聚,表明是其外殼蛋白引起某些變性造成的(王利國等,2000)。

4. 植物抑菌有效成分的提取

    植物有效成分的提取應依據其性質,選用對目標成分溶解度大而對其它成分溶解度小的溶劑,將所需活性成分溶解提取出來。溶劑的選擇一般遵循以下原則:對有效成分溶解度大,對雜質溶解度小;不能與有效成分起化學反應;溶劑價廉、易得且使用安全。常用的溶劑有水、乙醇、石油醚、氯仿、乙醚等。

    水作為提取溶劑,價廉、易得、使用安全,對中藥細胞穿透力強;能夠把藥材中的大多有效成分提取出來,熊運海等(2006)先將中草藥置于清水中浸泡 1 h,再向中草藥中加入 500 ml 水熬制 30 min,濾出汁液. 然后,另加 500 ml 水熬制20 min 后過濾即制成中草藥提取物。閆師杰等(2002)稱取丁香、大黃各 100 g 加 500 mL水浸泡 1 h,煮沸煎熬 20 min 濾出汁液,另加 500 mL 水再熬制 20 min 濾渣,合并兩次藥液定容到 1000 mL,即為中藥制劑。但水作溶劑對成分的選擇性較差,提取出的雜質較多,提取物易酸敗變質、不易長期保存,同時水作溶劑的一般需經過蒸煮、蒸發得到濃縮品;而許多果實類、塊根類、鱗莖類中草藥如五味子、枸杞子、人參、西洋參、何首烏、蘆薈、百合在粗加工的過程中要經過高溫烘烤,其藥效成分已造成部分流失。

    乙醇作溶劑溶解性能較好、溶解有效成分多、對細胞穿透力強、成分提取比較徹底、對藥材成分的選擇性較強,如淀粉、蛋白質、果膠、粘液質等雜質不易溶解,提取物易于保存。90% 以上乙醇含量常用于提取發油、有機酸、樹脂等,50%-70%乙醇多用于生物堿、苷類,含量 50% 以下用于提取蒽醌類、皂甙類的提取。用乙醇作溶劑經過冷提取(40 以下),然后減壓蒸餾回收溶劑并得到藥用成分,此法所需實驗設備簡易,乙醇可重復利用,得到有效成分多,試驗及生產中仍廣泛的使用。如用水、95%乙醇、丙酮提取連翹中的抗菌有效物質,發現 95% 乙醇提取物的抑菌效果最強、抑菌譜最廣(王維華等,1996)。

    氯仿、乙醚溶劑一般作為實驗室或有效成分檢驗時使用,毒性大,大規模生產應用較少。

    此外,影響提取效果的因素還有藥材的粉碎度、溶劑的濃度差、提取溫度、提取時間等。不同的植物種類應選擇適宜的提取方法。張紅醫等(2006)考察了乙醇體積分數、乙醇溶劑用量、浸泡時間、蒸餾時間和黃芩粒度5個因素對黃芩苷提取收率的影響,發現乙醇體積分數為 60%,溶劑用量 70~90 mL ,浸泡時間 0~3 h ,回流時間 120 min ,黃芩粒度取 0.1~0.5 mm 為最佳的提取條件。高保栓等(2004)采用水蒸汽蒸餾法,考察了四因素(粒度、浸泡時間、加水量、提取時間)三水平對其得量的影響,發現丁香揮發油的最佳工藝條件為粗粉,加 8 倍量水浸泡 40 min,提取 5 h。

    天然產物有效成分常用的提取方法包括煎煮法、水蒸氣蒸餾法、浸漬法、滲漉法、回流法等(中國科學院上海藥物研究所,1983)。近年來又出現了超臨界流體萃取法( SFE)、酶法、微波輔助提取法、超聲波技術提取法、半仿生提取法(酸堿法)、超微粉碎技術、真空液相層析等新技術和方法。

5.復配植物源殺菌劑的研究進展

    不同抑菌植物資源中含有的抑菌成分不同,這些不同的抑菌活性物質之間可存在協同作用,從而增強了抑菌活性。李麗等(2006)研究發現大黃、丁香和連翹 3 種提取物單獨使用時對交鏈孢菌的抑制率均在 45% 以下,但混合并加入其它提取物后,復配物的抑菌率達到 100%;大蒜和韭菜的提取物也有類似現象。汪生等(2007)發現烏梅、肉桂、八角、丁香復配后的抑菌效果要明顯強于單一使用效果,說明復配各成分之間存在協同作用。連翹、板蘭根等單味藥對嗜水氣單胞菌抑菌作用不明顯,組成復方后表現較強抑菌作用(高漢橋,1996)。但不同的抑菌活性物質之間也可能存在拮抗作用,李麗等(2006)發現大黃、丁香和連翹的提取物中單一使用時,對膠孢炭疽菌的抑菌率均為100%,但這 3 種提取物混合并加上其它同樣抑菌作用很強的提取物后,復配物的抑菌率僅為28%。抑菌活性物質之間協同作用的機理目前還不清楚,需進一步深入研究。

    不同的抑菌活性物質對各個病原菌的抑制效果不同,這些中草藥提取物混合后可以增大其抑菌譜。王興華(2005)從 20 種植物提取物中篩選出抑菌作用較好的幾種植物提取物組成復配提取物,發現復配后提取物對黃瓜黑斑病菌、青椒枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、禾谷類作物病菌病原菌的抑制效要顯著好于單一植物提取物。抑菌譜的加大一方面是由于抑菌活性物質之間的相加作用,另一方面也存在各個抑菌活性物質之間的協同作用。

    有些植物資源雖然其提取物對病菌有較好的抑制作用,但由于其價格昂貴,還不具備市場競爭優勢,無法得到大規模的開發應用。因此,我們通過幾種植物資源的復配使用,不僅降低了生產成本,也很有可能增加抑菌效果和抑菌譜。同時也防止了單一植物資源的過渡采伐使用而導致植物資源的匱乏。

    在實際生產中,要充分考慮抑菌活性物質之間的協同作用和相加作用,研制開發出廣譜、高效的植物源殺菌劑。同時又要考慮成本因素,選擇那些抑菌效果好,價格低的植物進行抑菌活性物質的提取應用。還要考慮到有殺菌抑菌效果的植物資源產量和可持續性,選擇那些產量大,能連續收獲的植物品種,才能滿足工廠化生產的需求,增強植物源殺菌劑在市場上的競爭力。  

6. 抗菌物質的檢測方法

    抗菌物質的檢測通常采用兩類方法,即離體測試和活體測試。離體測試包括病原菌和藥劑,不涉及寄主植物,常采用含毒介質培養法和孢子萌發法;活體測試包括組織篩選法與盆栽試驗法(張應烙等,2005)。離體測試法測定條件易于控制,操作簡便迅速,結果精確,是抗菌物質篩選常用的主要方法。但離體和活體篩選有時不具有相關性,單純的離體篩選易造成活性物質的錯選、漏篩(慕立義,1994),因此進行殺菌、抗菌活性物質篩選時,一般在離體篩選基礎上,應進一步活體篩選,避免錯選、漏篩,增加試驗結果的準確性和可靠性。

7. 植物源殺菌劑研究存在的問題

    植物中殺菌成分的提取效果及活性受提取方法、溶劑類型等多種因素的影響,其活性成分的鑒定,構校關系、殺菌機理研究也直接關系到殺菌劑的生物合成及推廣應用效果。

7.1擴大植物資源調查,建立殺菌植物資源數據庫

    我國擁有豐富的植物資源,僅藥用植物的種數就有 8000 種左右,其中一部分具有抑菌、殺菌作用,近年來許多學者通過不斷篩選,已經掌握了許多具有抑菌、殺菌作用的植物資源,為開發合成新型環保的農藥奠定了基礎。但是這些篩選研究相對集中在若干個科、屬,篩選工作存在重復性,缺乏系統性,今后應加大篩選的范圍,尤其一些偏遠地區、山區中可能存在著抗菌、殺菌植物寶貴資源。加強各地研究機構、高校之間聯系和協作研究,避免漏選,減少重復,建立殺菌植物資源數據庫,實現信息資源共享,推動植物源殺菌劑高效快速發展。

7.2植物資源抑菌、殺菌成分提取研究

植物體內活性物質種類、含量受遺傳因素、外界環境等因素的影響。因此同一植物其體內活性物質也因生長地域、氣候條件而不同,活性物質含量往往在植物特定部位、特定生長發育時期最高,今后的研究應充分考慮產地、提取部位、采摘時間等因素,以某個地區特定的殺菌植物為研究對象,確定其活性物質有效的部位和采摘提取時期,采用合理的提取分離手段才能得到純度高、效果好的抑菌物質。在采用傳統煎煮法、水蒸氣蒸餾法、浸漬法、滲漉法、回流法提取方法基礎上,應用超臨界流體萃取法( SFE)、酶法、微波輔助提取法、超聲波技術提取法、半仿生提取法(酸堿法)、超微粉碎技術、真空液相層析等先進技術方法,提高活性成分提取效率,對一些稀有植物,可以利用現代生物技術如組織培養技術、細胞培養技術,對植物資源進行快速繁殖,加快實驗室的提取分離技術工廠化的步伐,盡快將植物源殺菌劑應用于實際生產。

7.3 確定各有效成分間構效關系、深入抗菌機理研究

    現階段國內對植物源殺菌劑的研究還處在有效植物的篩選,粗提物的應用效果及提取物的有效成分含量的鑒定上,但對于有效成分間構效關系、抗菌機理的研究還處于起步階段,應綜合運用高分辨質譜、二維核磁共振譜、單晶X射線衍射法等技術確定有效成分的分子結構,研究其結構與活性的關系,以便進行結構修飾與改造,進行人工半合成或全合成,將其開發成為新型、安全、高效的殺菌劑。

7.4進行植物源殺菌劑的助劑研究,開發植物源殺菌劑新劑型

為提高植物源殺菌劑的有效性,應加強增效劑、滲透劑等助劑、不同殺菌劑之間的混合復配、殺菌劑活性成分穩定性的研究。在產品生產劑型方面,目前我國農藥的劑型是以乳油和可濕性粉劑為主。但乳油生產、貯運和使用中安全性較差,粉劑污染環境,農藥有效利用率低。因此應加快水溶劑、微乳劑等對環境造成的污染小,對人畜安全,綠色環保劑型的研究。

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